Scientific Reports volume 5, numero articolo: 15686 (2015) Citare questo articolo
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Le proteine disordinate sono altamente prevalenti nei sistemi biologici, controllano una miriade di processi di segnalazione e regolazione e i loro livelli e/o la localizzazione cellulare sono spesso alterati nelle malattie umane. A differenza delle proteine ripiegate, le proteine disordinate, a causa dell’eterogeneità e della dinamica conformazionale, non sono considerate bersagli farmacologici vitali. Abbiamo sfidato questo paradigma identificando attraverso lo screening NMR piccole molecole che si legano specificamente, anche se debolmente, al regolatore del ciclo cellulare disordinato, p27Kip1 (p27). Due gruppi di molecole legate a siti creati da cluster transitori di residui aromatici all'interno di p27. Le caratteristiche chimiche conservate all'interno di questi due gruppi di piccole molecole hanno mostrato complementarità con i loro siti di legame all'interno di p27, stabilendo relazioni struttura-attività per le interazioni disordinate tra piccole molecole e proteine. Infine, un composto ha contrastato la funzione inibitoria di Cdk2/ciclina A di p27 in vitro, fornendo la prova di principio che piccole molecole possono inibire la funzione di una proteina disordinata (p27) attraverso il sequestro in una conformazione incapace di ripiegarsi e legarsi a una proteina naturale. target regolatorio (Cdk2/ciclina A).
Le proteine intrinsecamente disordinate (IDP) sono altamente prevalenti nelle cellule eucariotiche e spesso svolgono funzioni di regolazione e segnalazione1. Come classe strutturale, gli IDP sono regolati più strettamente rispetto alle proteine ripiegate dal lievito all'uomo2 e, in caso di sovraespressione, sono più inclini ad alterare il fenotipo cellulare rispetto alle loro controparti ripiegate3. Pertanto, il mantenimento della normale omeostasi proteica disordinata è fondamentale per il comportamento cellulare. I fenotipi associati alla sovraespressione o all'iperattività delle proteine con domini ripiegati possono essere contrastati da piccole molecole inibitori, ad esempio, della funzione enzimatica (ad esempio, Gleevec che inibisce BCR-Abl nella leucemia mieloide cronica4) o delle interazioni proteina-proteina (ad esempio, ABT- 263 e ABT-199 che inibiscono BCL-2 e BCL-xL nelle neoplasie ematologiche e linfoidi5,6). Al contrario, le proteine disordinate rappresentano bersagli impegnativi per l'inibizione da parte di piccole molecole a causa delle loro conformazioni dinamiche ed eterogenee. Ciononostante sono stati fatti dei progressi. Ad esempio, è stato recentemente dimostrato attraverso analisi strutturali, biochimiche e funzionali che un inibitore della fosfatasi PTP1B (MSI-1436), con ruoli noti nel diabete, nell'obesità e nel cancro al seno, agisce attraverso un meccanismo allosterico legandosi a una regione regolatoria disordinata del l'enzima7. Inoltre, una piccola molecola (YK-4-279) che si lega all'oncoproteina di fusione disordinata EWS-FLI1 associata ai tumori della famiglia dei sarcomi di Ewing ha inibito il legame diretto con l'RNA elicasi A (RHA)8, un partner funzionale di EWS-FLI1 nelle cellule tumorali8 e alterazioni delle interazioni proteiche RHA-dipendenti e dello splicing dell'RNA9. Entrambi questi composti (MSI-1436 e YK-4-279) hanno mostrato effetti mirati nei test cellulari8,9. Altri studi hanno identificato piccole molecole che prendono di mira cMyc10,11,12 disordinato, α-sinucleina13 e il peptide β-amiloide di Alzheimer14. Un recente studio computazionale15 ha mostrato che una piccola molecola (10074-A4) precedentemente segnalata per modulare la funzione cMyc10 si lega in modi diversi a diverse molecole cMyc all'interno di un insieme di molte conformazioni disordinate, portando gli autori a suggerire il concetto di "nuvole di ligandi che si legano alle proteine nuvole". Negli studi discussi sopra, piccole molecole che prendono di mira le proteine disordinate sono state scoperte utilizzando una varietà di approcci, inclusi screening funzionali, screening di legame in vitro e/o screening computazionali. Lo screening basato sulla risonanza magnetica nucleare (NMR) di piccole molecole a basso peso molecolare chiamate frammenti (rivisti in 16) che si legano a bersagli proteici ripiegati è un metodo consolidato per identificare i "successi" iniziali nel processo di scoperta di farmaci17,18. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, lo screening dei frammenti basato su NMR non è stato applicato per identificare piccole molecole che si legano a un bersaglio proteico disordinato. Qui, abbiamo utilizzato lo screening basato su NMR per identificare molecole di frammenti che si legano e modulano la funzione della proteina disordinata prototipo, p27Kip1 (p27; nota anche come CDKN1B), un regolatore delle chinasi ciclina-dipendenti che controllano la divisione cellulare eucariotica19.
50% increase; Fig. 6a and Suppl. Fig. 9b), consistent with partial displacement of p27-D2 from Cdk2/cyclin A by SJ403. Furthermore, in the absence of p27-D2, SJ403 substantially inhibited Cdk2/cyclin A activity at concentrations that, in the presence of p27-D2, were associated with p27-D2 displacement and increased kinase activity (Fig. 6b and Suppl. 9c). Thus, we conclude that the primary effect of SJ403 is displacement of p27-D2 from Cdk2/cyclin A (through the binding of SJ403 to p27-D2) and partial restoration of kinase activity, even as a secondary effect of SJ403 is to inhibit kinase activity (through the binding of SJ403 to Cdk2/cyclin A). These results provide proof-of-principle that a small molecule (SJ403) inhibits the function of a disordered protein (p27-D2) through sequestration in a conformation incapable of binding and inhibiting Cdk2/cyclin A./p>20 Å) and that Group 2 molecules bind to compact conformations when at least two of the three critical aromatic residues within the different sub-regions (sub-domains D2.1, D2.2 and D2.3) are clustered. Interestingly, analysis of the MD trajectory showed that Y88 and either W60 or W76 were frequently in close contact but that all three residues were rarely in close proximity (Suppl. Fig. 10c). This suggested that there are several different conformations with clustered aromatic residues (in particular, Y88 and either W60 or W76) capable of binding to Group 2 compounds, consistent with mutagenesis results showing that either W60 or W76, but not both, are dispensable for Group 2 compound binding (Suppl. Fig. 5a–f). In summary, the new MD results for p27-D2 suggest strongly that transient conformational fluctuations that create and disrupt clusters of aromatic residues modulate the binding of Group 1 and Group 2 small molecules to p27-D2. These results are consistent with the identification of W60, W76 and Y88 by NMR as the principal sites for compound binding and with results showing that binding is altered through mutation of these residues./p>2,300 compounds that were screened failed to bind other regions of p27 (sub-domains D1 and LH), suggesting that these other regions lack a sufficient density of aromatic residues (specifically, W and Y residues) to specifically recognize small heterocyclic aromatic molecules. Sub-domain LH, in isolation, does not bind to Cdk2/cyclin A but sub-domain D1 binds cyclin A with high affinity (Kd, 42 nM)45. We speculate that the RxLFG motif within this latter region, due to its limited length, cannot adopt conformations that create binding pockets for small molecules, as is possible for the much longer D2 sub-domain. However, the low affinity of the Group 1 and 2 compounds for p27 limits their applicability toward our broader goal of modulating p27 function in cells and, ultimately, humans. How can the affinity of small molecules for p27 be increased? We propose that the Group 1 and 2 molecules cause a degree of conformational restriction within p27-D2 and that molecules that enhance this restriction will exhibit higher affinity. We envision that small molecules with greater "three-dimensionality", that present chemically diverse and complex features, will be better templates for binding and sequestering p27. Efforts based on two strategies are underway to optimize our fragment hits using synthetic chemistry. First, we are "growing" the Group 1 and 2 scaffolds by introducing diverse chemical moieties at various positions on the heterocyclic ring systems to enable additional interactions with residues near W60, W76 and Y88 within p27-D2. Second, when the growing experiments are complete, we will synthetically "link" the optimal Group 1 and Group 2 molecules to further enhance binding to p27-D2. The results of these future experiments will indicate whether synthetic strategies for compound optimization that have emerged from structure-based drug discovery can be applied to a disordered protein. In conclusion, we have discovered small molecules with "fuzzy SAR" that mediate specific binding to and inhibition of p27, demonstrating the potential to rationally "drug" disordered protein targets in the future./p>500,000 compounds; see below). First, commercial fragment collections (subsets of larger diversity collections filtered for ‘fragment-like’ characteristics) were filtered to remove molecules containing inorganic atoms, isotopes, or invalid structures and to remove molecules that were not available in sufficient quantity (<50 mg). Passing molecules were abstracted to Murcko scaffolds using Pipeline Pilot (‘Generate Fragments’ component in Accelrys v. 8.5 with alpha atoms preserved, see ref. 48 for the general method). These scaffolds were further filtered according to the following rules: number of reactive substructures = 0 (‘REOS’ filters49,50,51, number of rotatable bonds <= 3, number of heavy atoms >= 10, number of rings >= 1 and number of ring substitutions >1 for single ring systems and number of molecules present in the St. Jude HTS library containing the scaffold >= 8. Molecules containing these scaffolds were identified in the commercial fragment libraries and then prioritized for purchase according to highest Oprea complexity52. This library has the following average calculated physicochemical properties: MW = 246 ± 39 Da, number of atoms = 17 ± 3, log P = 1.7 ± 1.0, polar surface area = 63 ± 19 Å2, number of H-bond acceptors = 4.3 ± 1.4 and number of H-bond donors = 1.3 ± 0.9. The distributions of these and other chemical features of the two fragment libraries are summarized in Suppl. Fig. 12a./p>3.0.CO;2-Q" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291521-3773%2819990614%2938%3A12%3C1784%3A%3AAID-ANIE1784%3E3.0.CO%3B2-Q" aria-label="Article reference 36" data-doi="10.1002/(SICI)1521-3773(19990614)38:123.0.CO;2-Q"Article CAS Google Scholar /p>
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